Разработки высокоскоростной АСМ для исследования динамики белков

В этом интервью AZoNano беседует с доктором Джорджем Хитом из Университета Лидса, Великобритания, об основных принципах атомно-силовой микроскопии (АСМ), интеграции с современной оптической микроскопией и связанных с ней приложениях. Он также рассказывает о своих исследованиях с использованием высокоскоростного атомно-силового микроскопа NanoRacer для изучения динамики белков. В нем также рассматриваются методы, повышающие временное и пространственное разрешение АСМ до 10 микросекунд и субнанометровых уровней.

Что делает высокоскоростную АСМ ценной для изучения динамических биологических систем?

Высокоскоростная АСМ Это особенно ценно для изучения динамических биологических систем, поскольку позволяет нам фиксировать редкие и случайные структурные изменения в белках и биомолекулах с беспрецедентной детализацией.

В отличие от других методов, которым может не хватать разрешения, необходимого для наблюдения за этими изменениями, высокоскоростная АСМ обеспечивает высокое пространственное и временное разрешение, позволяя нам видеть отдельные молекулы и их взаимодействия в реальном времени.

Это имеет решающее значение для понимания сложных биологических процессов, таких как белок-белковые взаимодействия, динамика мембран и конформационные изменения, которые часто вызываются редкими событиями и происходят в течение коротких временных масштабов. Высокоскоростная АСМ позволяет нам отслеживать эти события по мере их возникновения и получать представление о механизмах, лежащих в основе биологических функций.

Как разработки в области высокоскоростной АСМ, особенно с использованием NanoRacer, могут устранить ограничения стандартной АСМ с точки зрения пространственного и временного разрешения?

Достижения в области высокоскоростной АСМ, особенно с НаноРейсер, устраняя ограничения стандартной АСМ за счет значительного улучшения пространственного и временного разрешения. Обычные методы АСМ часто страдают от низкой скорости сканирования и ограниченного разрешения, что затрудняет мониторинг динамических процессов в реальном времени. Однако с помощью NanoRacer и других высокоскоростных систем АСМ мы можем преодолеть эти ограничения.

Используя меньшие кантилеверы, более высокую частоту отвода сигналов и улучшенное управление обратной связью, мы можем достичь скорости сканирования до 55 кадров в секунду или даже выше.

Это позволяет нам фиксировать быстрые структурные изменения в беспрецедентных деталях, обеспечивая понимание биологических процессов, которые ранее были недоступны. Возможность выполнять линейное сканирование и локализацию АСМ повышает пространственное разрешение АСМ-изображений, позволяя нам отслеживать молекулярные взаимодействия на уровне отдельных молекул.

Высокоскоростная атомно-силовая микроскопия — визуализация ДНК со скоростью 50 кадров в секундуОн играет

Высокоскоростное АСМ-видео Bruker JPK NanoRacer® части одной молекулы ДНК, отображенной в жидкости на подложке из слюды + PLO в замкнутом цикле, видео содержит 1000 изображений, полученных без помощи пользователя со скоростью изображения 50 кадров в секунду, демонстрируя стабильность Низкая принудительная визуализация АСМ NanoRacer® на этих высоких скоростях: диапазон x 100 нм (100 пикселей), диапазон y 80 нм (80 пикселей), диапазон z 2,0 нм. Источник изображения: Брокер BioAFM

Можете ли вы привести примеры динамических биологических процессов, которые были успешно изучены с помощью высокоскоростной АСМ, в частности с помощью NanoRacer?

Высокоскоростная АСМ оказалась эффективной при изучении различных динамических биологических процессов. Одно примечательное исследование включало мониторинг динамики моторного белка миозина V, который перемещается по актиновым нитям. Это исследование выявило механизм масштабирования миозина V, что позволило понять, как моторные белки движутся и взаимодействуют с клеточной средой.

Мы также изучили поведение антимикробных пептидов, атакующих бактериальные мембраны, и кинетику связывания и несвязывания белков с липидными мембранами. Эти примеры демонстрируют универсальность высокоскоростной АСМ при изучении широкого спектра динамических биологических процессов с высоким пространственным и временным разрешением.

Изображение предоставлено: Брокер BioAFM

Как высокоскоростная АСМ позволяет отслеживать белок-белковые взаимодействия и конформационные изменения на уровне одиночных молекул?

Высокоскоростная АСМ позволяет отслеживать белок-белковые взаимодействия и конформационные изменения на уровне отдельных молекул, фиксируя эти события в режиме реального времени с высоким разрешением.

С НаноРейсерМы можем отслеживать взаимодействия между отдельными белковыми молекулами по мере их возникновения, что позволяет нам отслеживать события связывания и несвязывания, а также конформационные изменения с разрешением нанометрового масштаба.

Например, нам удалось изучить конформационные изменения белка аннексина V при его связывании с липидными мембранами в присутствии ионов кальция. Визуализируя белок на высоких скоростях, мы можем наблюдать, как он взаимодействует с мембраной и претерпевает структурные изменения в ответ на связывание.

Я разработал новый инструмент анализа изображений NanoLocz. Можете ли вы объяснить, как он обрабатывает комплексные данные, полученные в результате высокоскоростных наблюдений с помощью АСМ?

нанозамкиУ нас есть свобода Новый доступный инструмент анализа изображений решает проблему обработки комплексных данных, полученных в результате высокоскоростных наблюдений АСМ, с несколькими ключевыми функциями. Во-первых, он позволяет легко импортировать данные, поддерживая все форматы файлов AFM, обеспечивая совместимость с различными высокоскоростными системами AFM.

После импорта данных NanoLocz использует методы параллельной обработки для ускорения предварительной обработки и анализа, позволяя обрабатывать несколько изображений одновременно. Это существенно сокращает время, необходимое для обработки данных.

Одной из функций NanoLocz является автоматическое выравнивание, которое гарантирует правильное выравнивание и выравнивание АСМ-изображений, что повышает точность последующих анализов. Программное обеспечение также включает в себя усовершенствованные алгоритмы обнаружения частиц и сверхвысокого разрешения, позволяющие идентифицировать и повышать точность отдельных молекул, белковых комплексов или других структур даже в переполненных наборах данных.

Можете ли вы описать конкретное исследование или эксперимент, в котором высокоскоростная АСМ с использованием NanoRacer позволила получить новое представление о динамике биологической системы, которое ранее было невозможно с помощью других методов?

Одно примечательное исследование, в котором использовалась высокоскоростная АСМ с НаноРейсер Новое понимание динамики биологической системы дает исследование белкового комплекса BRC-BARD1, участвующего в репарации ДНК. Целью данного исследования является понимание того, как это соединение взаимодействует с ДНК на молекулярном уровне, что имеет решающее значение для нашего понимания механизмов репарации ДНК и их последствий для рака.

Традиционно структуру комплекса BRCA1-BARD1 было трудно выяснить с помощью таких методов, как криогенная электронная микроскопия (крио-ЭМ) или рентгеновская кристаллография из-за присущей ему гибкости. Однако высокоскоростная система АСМ с NanoRacer позволила исследователям напрямую визуализировать динамические взаимодействия между BRCA1-BARD1 и ДНК в реальном времени.

Используя высокоскоростную АСМ, исследователи заметили, что комплекс BRCA1-BARD1 может связываться с отдельными нуклеосомами и сшивать несколько нуклеосом — явление, ранее недостижимое с помощью других методов.

Это открытие дало важное понимание механизма, с помощью которого BRCA1-BARD1 способствует репарации ДНК. Это указывает на то, что комплекс может стабилизировать структуры ДНК во многих нуклеосомах, тем самым способствуя эффективным процессам восстановления.

Изображение предоставлено: Джордж Хит

Как линейное сканирование и локализация АСМ улучшают временное и пространственное разрешение АСМ-изображений и как эти методы улучшают наше понимание динамических биологических систем?

Линейное сканирование предполагает многократное сканирование одной линии по интересующей области. Это позволяет исследователям достичь более высокого временного разрешения, сосредоточив внимание на конкретных регионах, где происходят динамические события. Ограничивая область сканирования, линейное сканирование сокращает время, необходимое для захвата изображений, позволяя отслеживать быстрые биологические процессы с миллисекундным или даже микросекундным разрешением.

Эта технология расширяет нашу способность отслеживать динамические события, такие как изменения конформации белка или молекулярные взаимодействия, в режиме реального времени, предоставляя ценную информацию о кинетике и механизмах биологических процессов.

Локализация АСМ улучшает пространственное разрешение за счет локализации пиков в данных АСМ и восстановления изображений из этих локальных точек. Этот метод позволяет исследователям достичь разрешения, выходящего за пределы обычного АСМ-изображения, приближаясь к размеру отдельных атомов или молекулярных особенностей. Точно определяя места внутримолекулярных колебаний или белковых комплексов, локализация АСМ позволяет визуализировать мелкие структурные детали и характеризовать молекулярные взаимодействия с беспрецедентным разрешением.

Комбинируя линейное сканирование и локализацию АСМ, исследователи могут отслеживать динамические биологические процессы как во временном, так и в пространственном разрешении. Это позволяет визуализировать молекулярные движения, конформационные изменения и взаимодействия в беспрецедентных деталях, проливая свет на фундаментальные механизмы биологических функций.

Каковы потенциальные будущие направления развития высокоскоростной АСМ-технологии и как они могут повлиять на изучение динамических биологических систем?

Потенциальные будущие направления для продвижения Высокоскоростная технология АСМ Это обширное и многообещающее направление, включающее несколько ключевых областей, которые могут оказать влияние на изучение динамических биологических систем.

Одно из направлений предполагает дальнейшее повышение скорости и чувствительности высокоскоростных систем АСМ. Это может включать инновации в конструкции кантилевера, механизмах обратной связи и методах обнаружения, обеспечивающие более высокую скорость визуализации и более высокую чувствительность. Увеличивая временное разрешение высокоскоростной АСМ, исследователи могут более подробно фиксировать более быстрые биологические процессы, что позволяет изучать ранее недоступные динамические события.

Еще одно направление прогресса — повышение универсальности и возможностей высокоскоростной АСМ для изучения сложных биологических систем. Это может включать разработку новых методов и методов визуализации, адаптированных к конкретным биологическим вопросам, таких как визуализация на границе раздела живых клеток.

Интеграция с другими методами визуализации также является многообещающим направлением будущего прогресса в технологии высокоскоростной АСМ. Сочетание АСМ с такими методами, как флуоресценция, сверхвысокое разрешение или электронная микроскопия, может предоставить дополнительную информацию о динамических биологических процессах, позволяя исследователям коррелировать структурные и функциональные изменения на нескольких уровнях.

О докторе Джордже Хите

Джордж Хит — научный сотрудник университета, специализирующийся на экспериментальной биофизике с упором на высокоскоростную атомно-силовую микроскопию (АСМ). Его академический и профессиональный путь, отмеченный впечатляющим сочетанием исследований и разработок в области физики и наук о жизни, подчеркивает его стремление улучшить наше понимание биологических систем на молекулярном уровне.

Джордж продолжил свое высшее образование в Университете Лидса, где получил степень магистра физики (MPhys) и доктора философии (Ph.D.) по физике. После получения докторской степени Джордж продолжил свою работу в Университете Лидса в качестве постдокторанта с 2014 по 2017 год. В июле 2017 года Джордж расширил свой исследовательский горизонт, присоединившись к Медицинскому колледжу Вейла Корнелла в Нью-Йорке в качестве постдокторанта на два года. В 2019 году он вернулся в Университет Лидса, чтобы основать собственную исследовательскую группу, где в настоящее время занимает должность открытого научного сотрудника EPSRC, назначенного в Школе физики и астрономии и Школе биомедицинских наук.

Публикации Джорджа, активного вкладчика в научное сообщество, отражают его новаторский подход к биофизике. Его известные работы включают разработку АСМ локализации, АСМ-спектроскопии высоты и многочисленные исследования динамики белков и мембран. Этот вклад не только подчеркивает его опыт, но и его стремление расширить границы возможного в биофизических исследованиях.

Эта информация была получена, проверена и адаптирована из материалов, предоставленных Bruker BioAFM.

Для получения дополнительной информации об этом источнике посетите Брокер БиоАФМ